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Isolement des cellules mononucléées: les pièges à éviter

Réalisé par centrifugation sur un coussin de sucrose (le ficoll), l’isolement des cellules mononucléées du sang est une étape délicate qui peut impacter fortement la qualité de la suspension cellulaire obtenue. Voici les points d’attention à prendre en compte lors de la préparation de vos échantillons.

 

Principe de la méthode d’isolement

La méthode de l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique par gradient de densité consiste à centrifuger le sang déposé dans un tube conique, au-dessus d’une solution de polysaccharideb (le ficoll)  d’une densité de 1,077 à 20°C.

Durant la centrifugation du tube, les éléments figurés du sang plus denses que la solution de sucrose (érythrocytes et granulocytes) traversent la solution de sucrose et forment un culot au fond du tube alors que les éléments figurés moins denses (cellules mononucléées et plaquettes) s’accumulent au-dessus de celle-ci.

A la fin de l’étape de la centrifugation, les couches suivantes sont visibles dans le tube, de haut en bas :

- le plasma

- un anneau de cellules mononucléaires (CMN, ou PBMC en anglais) et de plaquettes

- la solution de ficoll

- le culot de globules rouges et de cellules polynucléaires

Cette séparation permet une récolte facile des cellules situées à l’interface ficoll/plasma.

 

Les solutions commerciales de ficoll fréquemment employées sont :

- le Ficoll-Paque™ (GE Healthcare)

- l’Histopaque-1077® (Sigma-Aldrich)

- LymphoPrep™ (StemCell Technologies)

- le Milieu de Séparation des Lymphocytes® (Eurobio).

 

Protocole de réalisation

De nombreux protocoles de réalisation existent dans la littérature avec quelques variations dans les paramètres de durée ou de vitesse de centrifugation. Nous vous présentons ici celui qui est utilisé en routine chez Lymphobank.

- diluer le sang à 50% dans du tampon PBS (ou toute autre solution saline : sérum physiologique, milieu de Hanks…)

- déposer dans un tube conique 1 volume de ficoll pour 2 volumes de sang (ex : 15 mL de ficoll puis 30 mL de sang dans un tube de 50 mL ou 4 mL de ficoll puis 8 mL de sang dans un tube de 15 mL).

- centrifuger à 400 g pendant 30 mn à 22±2°C

- recueillir dans un nouveau tube l’anneau de cellules mononucléées concentrées à l’interface ficoll/plasma

- resuspendre les cellules mononucléées dans du sérum physiologique ou du tampon PBS et les laver par centrifugation à 160 g pendant 10 mn à 22±2°C

- répéter l’opération de lavage puis resuspendre le culot cellulaire dans du milieu de culture pour utilisation

 

Les variantes

L’étape de dépôt du sang sur le ficoll étant délicate, plusieurs options permettent de limiter les risques liés à un dépôt du sang mal contrôlé ou trop lent et de standardiser l’opération (cf tableau)

 

Les points d’attention

Les paramètres pouvant altérer l’efficacité de l’isolement des cellules, que ce soit en termes de quantité ou de qualité (viabilité, fonctionnalité, phénotype) sont :

- Le dépôt du sang sur le ficoll : celui-ci doit être le plus doux possible afin d’éviter les perturbations à l’interface sang/ficoll. Outre les variantes décrites ci-dessus, une technique consiste, après avoir déposé le ficoll dans le tube, à incliner celui-ci quasiment à l’horizontale afin d’approcher le ficoll du bord du tube puis d'amener l'extrémité de la pipette contenant le sang au contact du ficoll avant de déposer le sang le plus doucement possible. Le tube est progressivement et lentement relevé à la verticale durant ou après le dépôt du sang. 

- Le respect de la vitesse, de la durée et de la température de centrifugation. L’utilisation d’une centrifugeuse calibrée et régulièrement contrôlée est essentielle pour garantir le respect des paramètres de centrifugation.

- L’utilisation de ficoll froid. Le ficoll peut être conservé à température ambiante tant que le flacon n’est pas entamé mais doit être conservé à +4°C après ouverture, pour éviter tout risque de contamination microbiologique. Si le ficoll est conservé à 4°C, il est indispensable de le ramener à température ambiante avant utilisation. En effet, le froid modifie sa densité, ce qui affecte la séparation des hématies.

- La vitesse de décélération à la fin de la centrifugation. Il est indispensable d’ôter le frein de la centrifugeuse afin que la décélération soit la plus lente possible afin de ne pas perturber l’interface ficoll/plasma où se situent les cellules mononucléées.

- La récupération de l’anneau de CMN. Mal réalisée, cette étape peut provoquer une perte d’échantillon. Il est possible d’aspirer et d’éliminer une partie du plasma dans une première étape afin de faciliter la récupération des cellules dans une seconde étape et maximiser la quantité de cellules obtenues.

- Un lavage insuffisant des cellules mononucléées. Un contact prolongé du ficoll avec les cellules s’avère toxique pour celles-ci. Il est donc indispensable de laver rapidement et extensivement les cellules mononucléées récupérées après la centrifugation afin d’éliminer les traces de ficoll ainsi que les plaquettes, qui peuvent avoir des effets inhibiteurs sur les fonctions lymphocytaires.